La gélose de Rappaport-Vassiliadis semi-solide modifiée (MSRV) est un milieu sélectif, utilisé pour l’isolement des Salmonelles mobiles. Il n’est pas adapté à la détection des salmonelles non-mobiles (Salmonella Gallinarum et Pullorum).
Développée par De Smedt et al, la composition du milieu dérive de celle du bouillon de Rappaport-Vassiliadis (RV) utilisé pour l’enrichissement sélectif des salmonelles dans les denrées alimentaires. Celui-ci a subi deux modifications pour devenir la gélose de Rappaport-Vassiliadis semi-solide modifiée (MSRV) :
– Une adjonction d’une faible quantité d’agar pour la texture semi-solide nécessaire à l’appréciation de la mobilité des salmonelles recherchées.
– Un réajustement de sa sélectivité par un abaissement du taux de chlorure de magnésium présent et l’ajout de Novobiocine à hauteur de 10 mg/L.
La gélose MSRV (ISO 6579-1 : 2017) entre dans le protocole de recherche des salmonelles dans le cadre des prélèvements réalisés dans l’environnement (matières fécales animales et échantillons environnementaux) des filières de production animale (élevages, couvoirs), ainsi que dans celui de la mise en évidence des salmonelles chez les oiseaux (œufs à couver, prélèvements d’organes) et chez les mammifères.
– L’efficacité bactériologique est fondée sur la capacité des salmonelles à migrer de façon sélective dans le milieu.
– Les bactéries contaminantes sont inhibées par la forte concentration en chlorure de magnésium, ainsi que par la présence de vert malachite.
– La Novobiocine permet d’inhiber la plupart des microorganismes à Gram positif et d’éviter le développement des Proteus.
– Les Salmonelles produisent un halo opaque, témoin de la culture.
– Si la présence de telles salmonelles est suspectée, les cultures obtenues sur le milieu de pré enrichissement doivent être repiquées sur les milieux appropriés, en suivant les procédures adaptées.
La composition peut changer sensiblement selon le fournisseur.
– Digestat enzymatique de tissus animaux et végétaux……………….4,59 g
– Hydrolysat acide de caséine………………………………………………….4,59 g
– Chlorure de sodium ……………………………………………………………..7,34 g
– Phosphate monopotassique …………………………………………………. 1,47 g
– Chlorure de magnésium anhydre …………………………………………10,93 g
– Vert malachite (oxalate)……………………………………………………..37,0 mg
– Agar agar bactériologique……………………………………………………..2,70 g
Du fait de sa composition, semi-solide, il est très compliqué de transporter le milieu MSRV. C’est pour cette raison que la plupart des fabricants le proposent principalement en poudre. Il faut donc la mélanger avec de l’eau, puis stériliser et couler dans des boites de Pétri sur le lieu d’usage. Dans cet article, nous nous sommes intéressés à la préparation de ce milieu pour lequel il faut prendre quelques précautions.
Le premier laboratoire de microbiologie alimentaire, prépare son milieu MSRV à la casserole. Sur des volumes de deux litres. De la même manière que pour le précédent, il s’agit de mettre en suspension cette fois-ci 63,2 g de milieu déshydraté dans 2 litres d’eau déminéralisée. Le mélange est porté à ébullition et y est maintenu pendant quelques minutes jusqu’à sa dissolution sous agitation constante. Le refroidissement se fait ensuite à température ambiante. L’ajout de Novobiocine se fait juste avant le coulage des boites à une température de 45°C en incorporant 20 mg de Novobiocine reconstitués avec 10 ml d’eau stérile. Le temps de prise en masse est d’environ 2h00.
Notre deuxième laboratoire de microbiologie alimentaire prépare son milieu MSRV en préparateur de milieu sur des volumes de 10L. Il s’agit donc de mettre en suspension 316 g de milieu déshydraté dans 10 litres d’eau déminéralisée. L’homogénéisation s’amorce alors par un système d’agitation des pales de l’auto-préparateur accompagnée par une montée en température. Le palier de stérilisation est une étape cruciale en raison de la sensibilité de ce milieu à des températures trop élevées (>100°C). Celle-ci doit donc atteindre son point maximal à 98°C pendant une minute avant de passer à l’étape de refroidissement à 44-45°C. L’ajout de Novobiocine s’opère au moment de la distribution en incorporant stérilement 100 mg de Novobiocine reconstituée avec 50 ml d’eau stérile dans le préparateur de milieu toujours sous agitation. La distribution se fait ensuite via un distributeur de milieu de culture, qui va remplir automatiquement et aseptiquement des boites de Pétri en plastique.
– Le temps de prise en masse est plus long que pour la plupart des milieux de culture ; il se situe entre 30 min et 1 heure.
– Un chauffage trop important ou pas assez important du milieu MSRV peut induire des faux positifs.
– Les boites coulées avec supplément peuvent être stockées pendant 15 jours à une température de 2-8°C à l’abri de la lumière.
L’utilisation d’un préparateur de milieu et d’un distributeur de milieu peut donc faciliter la maîtrise de la température mais permet également un gain de temps et la possibilité de préparer de plus gros volumes de milieu.
– Ensemencer trois gouttes (environ 0,1 ml) de la culture provenant d’un milieu de pré enrichissement, au centre d’une boîte de milieu.
– Incuber à (41,5 ± 1,0) °C, pendant (24 ± 3) heures, sans retourner les boîtes. Au constat de l’absence de migration en 24 heures, l’incubation sera prolongée de (24 ± 3) heures supplémentaires.
La température d’incubation ne devra jamais être supérieure à 43°C.
Boite de Pétri avec du milieu MSRV distribué via un distributeur de milieu de culture :
Après la période d’incubation, les microorganismes mobiles développent un halo de croissance blanc opaque depuis le point d’inoculation.
La confirmation et l’identification sont ensuite opérées par des tests biochimiques et sérologiques en prélevant deux colonies caractéristiques isolées.
Salmonella Typhimurium sur MSRV. Les zones opaques couvrent presque tout le milieu :
Références bibliographiques
