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Fabrication des diluants : Eau peptonée tamponnée et bouillon de Fraser
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L’eau peptonée tamponnée et le bouillon de Fraser sont des diluants couramment utilisés lors de la préparation d’échantillons de produits alimentaires ou lors de contrôles environnementaux.
L’EPT est utilisée comme diluant pour le dénombrement des microorganismes dont Listeria monocytogenes et comme milieu de pré-enrichissement non sélectif pour la recherche de Salmonelles dans les produits alimentaires ou les échantillons environnementaux.
Le bouillon de Fraser quant à lui est recommandé pour l’enrichissement sélectif et différentiel de Listeria monocytogenes dans les produits alimentaires et notamment dans le lait et les produits laitiers (4).
Si l’utilisation de l’EPT et du bouillon de Fraser est largement sollicitée en laboratoire de contrôle qualité microbiologique, deux approches se discutent dans la gestion de ces grands volumes de diluants : Acheter du prêt à l’emploi conditionné en poches, flacons ou en tubes ou fabriquer soi même les diluants, en autoclave ou en autopréparateur de milieux.
Nous allons tenter dans cet article de mettre la lumière sur cette fabrication « Maison » de l’EPT et du bouillon de Fraser de plus en plus courante en laboratoire, souvent pour une question de coût mais pas que.
Mais d’abord, comment fabrique-t-on ces diluants ?
L’eau peptonée tamponnée :
◉ Dissoudre la base de diluant déshydratée dans de l’eau purifiée à raison de 20g/1L d’eau.
◉ Répartir en tubes ou flacons.
◉ Autoclaver 15 minutes à 121°C.
Le bouillon de Fraser
◉ Mettre en solution le milieu déshydraté du bouillon de Fraser dans de l’eau distillée ou déminéralisée à raison de 55g/1L d’eau.
◉ Agiter lentement jusqu’à dissolution complète.
◉ Répartir en tubes.
◉ Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
◉ Refroidir jusqu’à 25°C.
◉ Dans chaque tube de bouillon Fraser de base, ajouter aseptiquement 0,1 mL d’une solution stérile de citrate ferrique ammoniacal à 5%.
◉ Dans les tubes ainsi préparés transférer 0,1 mL de culture obtenue préalablement sur un bouillon d’enrichissement primaire (bouillon de Fraser-demi).
◉ Homogénéiser parfaitement.
◉ Incuber pendant 24 et 48 heures à 37°C.
On y trouve de la souplesse dans l’autonomie :
Fabriquer ses diluants soit même permet d’ajuster les quantités fabriquées à l’activité du laboratoire pas toujours prévisible, cela évite les pertes ou les urgences d’approvisionnement en cas d’une augmentation inattendue du nombre d’échantillons. Utiliser un autopréparateur de milieux permet d’autant plus cette flexibilité grâce à la possibilité de préparer entre 3L et 30 L de diluant selon les besoins du laboratoire.
Les tubes, flacons et poches de bouillon prêt à l’emploi se stockent à une température entre 2 et 25°C quand les bases déshydratées, elles, se stockent à des températures entre 2 et 30°C. Ces petits 5 degrés de différence peuvent être à l’origine de grands désagréments si des couacs de maitrise des températures se produisent et cela arrive malheureusement …
Que dit la norme (ISO 11133-2014)?
Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production, stockage et essais de performance des milieux de culture
Chapitre 4.3.3 Eau: «…Pour la préparation des milieux de culture, utiliser uniquement de l’eau purifiée, c’est-à-dire de l’eau distillée, déminéralisée, déionisée ou produite par osmose inverse, ou de l’eau de qualité équivalente exempte de substances susceptibles d’inhiber ou d’influencer la croissance des micro-organismes dans les conditions d’essai, par exemple, des traces de chlore, d’ammoniac et d’ions métalliques…».
Chapitre 4.3.4 Pesée et réhydratation: «…En suivant les précautions de sécurité appropriées, peser soigneusement la quantité nécessaire de milieu déshydraté ou d’ingrédients individuels et mélanger en ajoutant progressivement le volume d’eau nécessaire pour éviter la formation d’agrégats. Utiliser une balance suffisamment précise. Il convient que les erreurs maximales admissibles soient de 1 % ou moins, comme indiqué dans l’ISO 7218 et l’ISO 8199. Sauf indication contraire, les ingrédients sont ajoutés au volume d’eau spécifié, plutôt que de compléter ce volume. … ».
Chapitre 4.3.5 Dissolution et dispersion: «…Les milieux déshydratés, exigeant une dispersion rapide, doivent être agités à intervalles réguliers ou en continu, puis chauffés si nécessaire pour être dissous. Il convient de laisser s’humidifier les milieux contenant de la gélose pendant plusieurs minutes avant de les chauffer tout en homogénéisant pour favoriser la dissolution puis à les répartir si nécessaire avant autoclavage. Éviter toute surchauffe du milieu… ».
Que dit la norme (ISO 7218-2007)?
Microbiologie des aliments pour la consommation humaine et l’alimentation animale. Les conditions générales requises et le guide pour l’examen microbiologique .
Chapitre 5.7.1 Description:
«…Un autopréparateur de milieux de culture sert à la stérilisation de grands volumes de milieux de culture (> 1L). Il est constitué d’un équipement avec une cuve de chauffage, une veste d’eau et un système d’agitation constante. L’équipement doit avoir aussi un mesureur de température, de pression, un chronomètre et une valve(soupape) de sécurité. De plus, l’équipement doit avoir un système de serrure de sécurité, qui empêche l’ouverture à plus de 80°C … ».
Chapitre 5.7.2 Usage:
«…Les instructions du fabricant doivent être suivies dans tous les cas. L’ensemble du processus de production se déroule au sein de l’équipe. Après l’addition de tous les ingrédients, ils se dissout avec le chauffage et l’agitation. Il suit ensuite avec la stérilisation … ».
Chapitre 5.7.3 Entretien:
«…Nettoyage et rinçage de l’autopréparateur avec de l’eau purifiée entre chaque cycle de préparation du milieu …».
Chapitre 5.7.4 Vérification:
«…L’autopréparateur doit être maintenu en bon état de marche et inspecté régulièrement par du personnel qualifié et compétent, conformément aux instructions du fabricant …».
La validation initiale devrait couvrir l’étude de la performance de chaque cycle et de chaque volume moyen utilisé dans la routine. Ces étapes doivent être répétées après chaque modification ou réparation majeure. Deux sondes de température, l’une près de l’autre sonde de contrôle avec la distance au premier peut être employée pour démontrer l’uniformité de la température.
La température et la durée de chaque cycle doivent être enregistrées et surveillées.
Points critiques dans la préparation des diluants:
Stérilité: La température doit être assez élevée pour stériliser le diluant (Ex.: 121°C-15min, 110°C-20min)
Fertilité: La température ne doit pas être trop élevée pour ne pas brûler le diluant (destruction de sucre, peptones, etc).
Homogénéité: De la dissolution et de la température.
Répétabilité: Qui peut se répéter toujours avec les mêmes paramètres pour aboutir à un même niveau de qualité à chaque fabrication.
Autopréparateur VS Autoclave :
À la vue des points critiques qui jonchent la préparation des diluants, l’utilisation d’un autopréparateur semble naturellement plus adéquat que l’utilisation de l’autoclave à fortiori pour de grands volumes et ce pour différentes raisons :
La maîtrise de la température : pour rappel et selon l’ISO, l’autoclave a une variation de +/- 3°C minimum et est plus lent au refroidissement (45min) alors que l’autopréparateur est à une variation de +/- 0.5°C et est plus rapide pour refroidir (15-20min), ce qui permet d’éviter toutes les problématique de stérilité et de fertilité.
La maîtrise de l’homogénéité: agitation automatique assurée par les pales de l’autopréparateur assure un brassage optimal réglable selon le type de bouillon que l’on souhaite fabriquer.
La sonde permet quant à elle de maîtriser la température dans le diluant de façon continue.
Les additifs: L’ajout maîtrisé et en toute sécurité des additifs dans un autopréparateur.
Les tests de fertilité et de stérilité:
Selon la norme ISO 11133 chaque lot de diluant fabriqué doit être soumis à des tests de fertilité et de stérilité.
BIBLIOGRAPHIE :
ISO 6579 : Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.
ISO 6785 : Lait et produits laitiers – Recherche de Salmonella spp.
ISO 6887-1 : Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 1 : règles générales pour la préparation de la suspension mère et des dilutions décimales.
ISO 6887-2 : Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 2 : règles spécifiques pour la préparation des viandes et produits à base de viande.
ISO 6887-4 : Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 4 : règles spécifiques pour la préparation de produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche.
ISO 6887-5 : Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 5 : règles spécifiques pour la préparation du lait et des produits laitiers.
ISO 6887-6 : Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 6 : règles spécifiques pour la préparation des échantillons prélevés à l’étape de production primaire.
ISO 19250 : Qualité de l’eau. Dosage d’espèces de Salmonella.
DONNELLY, C.W., and BAIGENT, G.J. 1986 : Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk.
Applied and Environmental Microbiology, 52 : 689-695 : FRASER, J.A., and SPERBER, W.H.. 1988. Rapid detection of Listeria spp. in food and environmental samples by esculin hydrolysis. Journal of Food Protection, 51 : 762-765.
NF EN ISO 11290-1 (V 08-028-1). Février 1997 : Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1 : Méthode de recherche.
XP CEN ISO/TS 11133-2 (V 08-104-2). Janvier 2004 : Microbiologie des aliments. Guide pour la préparation et la production des milieux de culture. Partie 2 : Guide général pour les essais de performance des milieux de culture.
NF EN ISO 11290-1/A1 (V 08-028-1/A1). Février 2005 : Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1 : Méthode de recherche. Amendement 1 : Modification des milieux d’isolement, de la recherche de l’hémolyse et introduction de données de fidélité.
